CARACTERIZAÇÃO DA PLURIPOTÊNCIA DE CÉLULAS-TRONCO DE PLURIPOTÊNCIA INDUZIDA HUMANAS PARA APLICAÇÃO NA BIOENGENHARIA DE TECIDOS HEPÁTICOS

As iPSC são células somáticas adultas que foram geneticamente reprogramadas para retornar a um estado pluripotente, semelhante ao das células-tronco embrionárias. A pluripotência é a capacidade da célula de se autorrenovar indefinidamente e se diferenciar nos tipos celulares dos três folhetos embrionários ectoderma, mesoderma e endoderma. A caracterização da pluripotência consiste na confirmação de que uma célula reprogramada atingiu o estado de pluripotência. Este estudo visa utilizar a tecnologia das iPSC como uma alternativa para pacientes com graves doenças hepáticas crônicas onde o único tratamento é o transplante. A realização da caracterização ocorre por meio de vários ensaios de caracterização. Neste estudo utilizou-se o RT-PCR, imunofluorescência, citometria de fluxo e diferenciação espontânea. Inicialmente as iPSC foram descongeladas, expandidas e após alcançarem a confluência de 80% as células foram processadas para a execução das análises. O RT-PCR foi realizado para comprovar a ausência dos transcritos virias do Sendai SeV, KOS, KLF4 e c-Myc utilizados na reprogramação da população de eritroblastos oriundos das células mononucleares do sangue periférico isoladas das amostras do Pac 48. Em seguida, foi analisada a expressão dos transcritos relacionados a pluripotência DMNT3B, DPPA4, KLF4, LIN28, NANOG, NODAL, OCT3/4, REX1 e SOX2. Confirmando os resultados do RT-PCR, o ensaio de imunofluorescência foi realizado para identificar a expressão de proteínas, foram usados os marcadores intracelulares OCT3/4, SOX2 e NANOG, e os marcadores de superfície SSEA4 e TRA1-81. Adicionalmente foi realizada a análise quantitativa por citometria de fluxo para identificar a expressão dos marcadores intracelulares OCT3/4, SOX2, NANOG, e os marcadores de superfície SSEA4 e TRA1-60. Por fim, foi realizado o ensaio de diferenciação espontânea onde foi identificada a expressão dos três folhetos embrionários utilizando os marcadores HNF4 para endoderma, Brachyury para mesoderma e Nestina para ectoderma. Concluiu-se com eficiência a caracterização da pluripotência da iPSC Pac 48. Foi utilizado um compilado de técnicas de caracterização neste estudo, possibilitando o desenvolvimento de uma ferramenta poderosa e fundamentada por achados de outros autores e colaboradores descritos na literatura.