CARACTERIZAÇÃO DE UM MODELO EXPERIMENTAL DE MICROGLIA PARA INVESTIGAÇÃO DA FISIOPATOLOGIA DA FENILCETONÚRIA

A fenilcetonúria (PKU) é um erro inato do metabolismo da fenilalanina (Phe) causado pela deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase (PAH), levando ao acúmulo de Phe nos líquidos e tecidos de pacientes. Os principais sinais e sintomas da PKU são neurológicos, e acredita-se que sejam resultado de efeitos neurotóxicos da Phe. Considerando-se que os mecanismos da neurotoxicidade da Phe ainda não estejam bem elucidados, e que estudos sugerem o envolvimento da microglia na fisiopatologia da PKU, o presente trabalho buscou caracterizar um modelo experimental in vitro para investigação dos efeitos da Phe sobre células da microglia utilizando células BV-2. Inicialmente, foram coletadas de bancos de dados informações sobre a expressão dos genes que codificam a enzima PAH e os transportadores de aminoácidos LAT (1-4) em células humanas. Os dados coletados mostraram que as células da microglia humana não expressam PAH e, dentre as células humanas investigadas, a microglia é a que apresenta maior expressão do gene LAT1, que codifica o principal transportador de Phe. Análises por RT-PCR demonstraram que, da mesma forma que a microglia humana, as células BV-2 expressam Lat1, mas não expressam Pah, indicando que a Phe pode ser transportada para dentro dessas células sem ser metabolizada pela enzima PAH. Análises por imunofluorescência confirmaram que as células BV-2 apresentam marcadores clássicos de microglia (Iba-1). Células BV-2 foram, então, incubadas na ausência (controle) ou presença de H₂O₂ 0,1 mM ou Phe (1, 2,5 ou 5 mM) por 48h. Imagens de microscopia de campo claro mostraram que a incubação com H₂O₂ 0,1 mM ou Phe 5 mM induziram alterações morfológicas evidentes nas células BV2 e promoveram um aumento na liberação de LDH em comparação ao grupo controle, indicando uma redução da viabilidade celular. Além disso, as concentrações de Phe 2,5 mM e 5 mM inibiram a atividade total da enzima LDH. Por fim, avaliou-se o efeito de Phe sobre o conteúdo de grupos sulfidrila, indicador do estado redox celular, e se observou que Phe 5 mM e H₂O₂ 0,1 mM diminuíram o conteúdo desse marcador. Em conjunto, os resultados sugerem que as células BV-2 podem ser utilizadas para o estudo da participação da microglia na fisiopatologia da PKU.